وارئه‌های ژنتیکی نادر خطر بالای ADHD را ایجاد می‌کنند و به زیست‌شناسی نورونی ارتباط دارند

شرکت‌کنندگان

• ADHD
• توالی‌یابی نسل جدید

چکیده

اختلال نقص توجه/بیش‌فعالی (ADHD) یک اختلال رشد عصبی با شروع در دوران کودکی است که مؤلفه ژنتیکی بزرگی دارد¹. این اختلال حدود ۵٪ از کودکان و ۲٫۵٪ از بزرگسالان را تحت تأثیر قرار می‌دهد² و با چندین پیامد جدی مرتبط است^{3,4,5,6,7,8,9,10,11}. وارئه‌های ژنتیکی رایج مرتبط با این اختلال شناسایی شده‌اند^12,13، اما نقش وارئه‌های نادر در ADHD عمدتاً ناشناخته است. در این پژوهش، با تحلیل وارئه‌های کدینگ نادر در داده‌های توالی‌یابی اگزوم از ۸٬۸۹۵ فرد مبتلا به ADHD و ۵۳٬۷۸۰ فرد کنترل، سه ژن (MAP1A، ANO8 و ANK2؛ P < 3.07 × 10⁻⁶؛ نسبت‌های شانس 5.55–15.13) که با ADHD ارتباط دارند، شناسایی کردیم. شبکه‌های تعامل پروتئین‑به‑پروتئین این سه ژن برای ژن‌های ریسک وارئه نادر در اختلالات دیگر رشد عصبی، و برای ژن‌های دخیل در سازماندهی سیتو اسکلت، عملکرد سیناپس و پردازش RNA غنی‌سازی شدند. ژن‌های ریسک وارئه نادر برتر، بیان بالاتری در میان مراحل پیش‌ و پس‌زایمان توسعه مغز و در چندین نوع سلول نورونی، از جمله نورون‌های گاباری (تولیدکننده گاما‑آمینوبوتریک اسید) و دوپامین‌ساز، نشان دادند. وارئه‌های مخرب با وضعیت اجتماعی‑اقتصادی پایین‌تر و سطوح تحصیلی کمتر در افراد مبتلا به ADHD مرتبط بودند و هر وارئه مخرب نادر منجر به کاهش ۲٫۲۵ نمره در ضریب هوشی (IQ) در نمونه‌ای از بزرگسالان با ADHD (n = 962) شد. افراد مبتلا به ADHD و ناتوانی ذهنی بار وارئه‌های نادر بیشتری داشتند، در حالی که سایر هم‌دوشی‌های روان‌پزشکی تنها برای مجموعه‌های ژنی خاص مرتبط با آن هم‌دوشی‌ها بار افزایشی نشان دادند. این نکته نشان می‌دهد که هم‌دوشی‌های روان‌پزشکی در ADHD عمدتاً توسط وارئه‌های نادر در ژن‌های خاص هدایت می‌شوند، نه توسط بار کلی افزایشی در ژن‌های محدود.

مقدمه

اختلال نقص توجه/بیش‌فعالی (ADHD) یک اختلال رشد عصبی است که حدود ۵٪ از کودکان و ۲٫۵٪ از بزرگسالان در سرتاسر جهان را تحت تأثیر قرار می‌دهد². این اختلال با مجموعه‌ای از پیامدهای جدی ارتباط دارد، از جمله خطر بالاتر اختلالات مصرف مواد^3,4، حوادث⁵، مرگ زودرس⁶، بیکاری⁷، زندان و جرایم⁸، خودکشی⁹ و بیماری‌های متابولیک^10,11. درک مکانیزم‌های زیستی که این اختلال را به‌وجود می‌آورند برای فهم چگونگی پیشرفت آن و امکان درمان در آینده بسیار حائز اهمیت است.

سهم بزرگی از ریسک ADHD می‌تواند به‌وسیله ژنتیک توضیح داده شود که برآورد ارث‌پذیری دوقلوها بین ۷۷ تا ۸۸٪ است¹. مطالعات بزرگ ارتباط سراسری ژنوم (GWAS) نشان داده‌اند که وارئه‌های ژنتیکی رایج ۱۴ تا ۲۲٪ از تغییرات کلی مسئولیت (liability) را توضیح می‌دهند^12,13. جدیدترین GWAS مربوط به ADHD ۲۷ مکان ژنی معنادار شناسایی کرد و برآورد کرد که حدود ۷٬۳۰۰ وارئه رایج ۹۰٪ از ارث‌پذیری تک‌نوکلئوتید (SNP) ADHD را توضیح می‌دهند¹³. بنابراین ADHD به‌طور قابل‌توجهی پلی‌ژنیک است، با درصد قابل‌توجهی از ریسک که توسط تغییرات ژنتیکی رایج توضیح می‌شود؛ با این حال، بررسی وارئه‌های نادر نیز ضروری است تا بخش بیشتری از ارث‌پذیری را توجیه کنیم. پیشتر ثابت کرده‌ایم که وارئه‌های مخرب نادر در ژن‌های محدود تکاملی نقش مهمی در ADHD دارند، به‌سطحی که با آنچه در اوتیسم یافت شده است، قابل مقایسه است¹⁴.

اگرچه وارئه‌های کدینگ نادر ممکن است تنها بخش کوچکی از کل مسئولیت را توضیح دهند، اما می‌توانند ریسک قابل‌توجهی را به‌صورت فردی ایجاد کنند و بر خلاف وارئه‌های رایج، اغلب ژن علت را مستقیماً مشخص کرده و پیامدهای عملکردی محتمل را نشان می‌دهند، که سرنخ‌هایی برای درک علت‌شناسی زیرین ADHD فراهم می‌آورند.

در اینجا نتایج یک مطالعه توالی‌یابی کل اگزوم در ADHD را ارائه می‌کنیم و سه ژن مهم را شناسایی می‌کنیم که در افراد مبتلا به ADHD بار وارئه‌های مخرب نادر بیشتری نسبت به افراد کنترل دارند. ما بینش‌هایی درباره ساختار ژنتیکی و مکانیزم‌های نوروبیولوژیک درگیر در ADHD فراهم می‌کنیم، با اتصال ژن‌های ریسک وارئه‌های نادر به داده‌های بیان ژن در بافت‌های مغزی و انواع سلول‌ها، و از طریق تجزیه و تحلیل شبکه‌های تعامل پروتئین‑به‑پروتئین (PPI) ژن‌های ریسک وارئه‌های نادر شناسایی شده. بار وارئه‌های مخرب نادر را در میان حالات مختلف هم‌دوشی‌ها ارزیابی می‌کنیم و نشان می‌دهیم که وارئه‌های مخرب نادر بر وضعیت اجتماعی‑اقتصادی (SES) و عملکرد شناختی افراد مبتلا به ADHD تأثیر می‌گذارند.

توالی‌یابی افراد از همگروه iPSYCH

داده‌های توالی‌یابی کل اگزوم ۸٬۸۹۵ فرد مبتلا به ADHD و ۹٬۰۰۱ فرد کنترل از iPSYCH دانمارکی^15,16 (روش‌ها، جدول تکمیلی 1 و شکل داده‌های گسترده 1) را تجزیه و تحلیل کردیم، که اندازه نمونه را دو برابر مطالعه پیشین ما کرد¹⁴.

ما بر وارئه‌های نادر تمرکز کردیم که تعداد آلِل آن‌ها در iPSYCH (۱۷٬۸۹۶ نفر؛ شکل‌های تکمیلی 1 و 2) بیش از پنج نبوده و زیرمجموعه‌ای از افراد با نژاد اروپایی (غیر‑فنلاندی) از پایگاه داده تجمیعی ژنوم (gnomAD) که تشخیص اختلال روان‌پزشکی نداشته‌اند¹⁷ (۴۴٬۷۷۹ نفر) را در نظر گرفتیم. میان افراد شامل‌شده هم‌دوشی بالایی با ناتوانی ذهنی (ID) وجود داشت (۱۸٫۴٪؛ جدول تکمیلی 1) و بدین‌دلیل اثر ID همزمان با اجرای تجزیه و تحلیل با و بدون ID ارزیابی شد.

تأثیرات در دسته‌بندی‌های عملکردی

وارئه‌های نادر بر اساس اثر عملکردی آن‌ها بر پروتئین کدگذاری‌شده گروه‌بندی شدند و بار آن‌ها در ADHD نسبت به افراد کنترل برای تمام ژن‌های خودکار (۱۸٬۸۶۶ ژن) و ژن‌های خودکار با احتمال عدم تحمل نقص عملکردی (pLI) ≥ 0.9 (۲٬۸۱۱ ژن) ارزیابی شد؛ از این پس به این ژن‌ها «ژن‌های محدود» می‌گوییم. ما بار قابل‌توجهی از وارئه‌های مخرب پروتئین‑تقطیع‌کننده (rPTVs) در ADHD نسبت به افراد کنترل در تمام ژن‌ها (نسبت شانس (OR) = 1.06، بازه اطمینان ۹۵٪ = [1.04، 1.08]، P = 2.41 × 10⁻⁷)، و بار بیشتری در ژن‌های محدود (OR = 1.35، CI = [1.26، 1.45]، P = 1.52 × 10⁻¹⁷; شکل 1a و جدول تکمیلی 2) یافتیم. مطابق با مشاهدات در اسکیزوفرنی¹⁹، این اندازه اثر مشابه آنچه برای وارئه‌های میسنس جدی مخرب نادر (rSevereDMVs؛ تعریف به‌عنوان وارئه‌هایی با نمره MPC > 3) در تمام ژن‌ها (OR = 1.29، CI = [1.09، 1.54]، P = 4.11 × 10⁻³; شکل 1a و جدول تکمیلی 2) بود. بنابراین، rPTVs و rSevereDMVs با هم گروه‌بندی شد (به‌عنوان وارئه‌های کلاس I) در تحلیل کشف ژن. بار وارئه‌های میسنس نادر پیش‌بین‌کننده اثر متوسط بر عملکرد پروتئین (rModerateDMVs؛ ۲ ≤ نمره MPC ≤ ۳) به‌طور معنی‌دار در ADHD افزایش یافت، اما با اندازه اثر کمتر (OR_{all_genes} = 1.11، CI = [1.07، 1.16]، P = 1.43 × 10⁻⁸; شکل 1a و جدول تکمیلی 2) نسبت به وارئه‌های کلاس I؛ بنابراین این‌ها به‌صورت جداگانه تحلیل شد (به‌عنوان وارئه‌های کلاس II). برای مقایسه، هیچ افزایشی در بار وارئه‌های سینونیم نادر در ADHD در ژن‌های محدود مشاهده نشد (شکل 1a).

a، نسبت شانس (OR) وارئه‌های مخرب پروتئین‑تقطیع‌کننده (rPTVs)، وارئه‌های مخرب میسنس جدی (rSevereDMVs)، وارئه‌های میسنس متوسط (rModerateDMVs) و وارئه‌های سینونیم نادر (rSYNs) در تمام ژن‌ها (علامت‌گذاری با زرد) و در ژن‌های محدود (pLI ≥ 0.9؛ علامت‌گذاری با قرمز) در افراد مبتلا به ADHD (n = 8,895) و در افراد کنترل (n = 9,001). نقاط نشان‌دهنده تخمین‌ مقدار OR هستند و خط‌های خطا بازه اطمینان ۹۵٪ (CIs) مرتبط را نشان می‌دهند. به‌دلیل شباهت اندازه اثر rPTVs و rSevereDMVs در ژن‌های محدود (pLI ≥ 0.9) این وارئه‌ها در کلاس I گروه‌بندی شدند و rModerateDMVs به‌عنوان کلاس II دسته‌بندی شد. توجه: تعداد rSYNs در هر فرد به‌عنوان یک متغیر هم‌متغیر در تحلیل‌ها استفاده می‌شود، بنابراین امکان آزمون تفاوت در بار rSYN در تمام ژن‌های خودکار وجود ندارد. b، تعداد وارئه‌های کلاس I (rPTVs + rSevereDMVs) در ژن‌های محدود (pLI ≥ 0.9) به‌صورت متوسط در هر فرد. ADHD، افراد تشخیص‌داده‌شده با ADHD صرف‌نظر از هر هم‌دوشی؛ ADHDwoID، افراد تشخیص‌داده‌شده با ADHD اما بدون ID؛ ADHDwID، افراد تشخیص‌داده‌شده با هر دو ADHD و ID. نسبت‌های شانس و مقادیر دو‑سویه P با استفاده از رگرسیون لجستیک در a،b محاسبه شد.

وارئه‌های کلاس I در ژن‌های محدود در حدود یک از هر پنج فرد مبتلا به ADHD شناسایی شد (شکل 1b، جدول تکمیلی 3 و شکل تکمیلی 3)، که نشان می‌دهد وارئه‌های بسیار مخرب در اکثر افراد ADHD به‌عنوان عامل خطر بیماری نقش ندارند.

هیچ تفاوتی در بار وارئه‌ها بین افراد مرد و زن مبتلا به ADHD مشاهده نشد (شکل تکمیلی 4)، که نشانگر بار مشابهی از وارئه‌های نادر در دو جنس است، همان‌طور که برای وارئه‌های رایج نیز مشاهده می‌شود^21,22.

کشف ژن‌های ADHD

برای افزایش توان شناسایی ژن‌های ریسک وارئه نادر در ADHD، گروه کنترل با ترکیب کنترل‌های iPSYCH با ۴۴٬۷۷۹ نفر از gnomAD¹⁷ گسترش یافت. در مجموع، ما ۸٬۸۹۵ فرد مبتلا به ADHD و ۵۳٬۷۸۰ فرد کنترل را تجزیه و تحلیل کردیم، به‌گونه‌ای که فقط نواحی ژنومیک با داده‌های با کیفیت بالا در نمونه‌های iPSYCH و gnomAD ارزیابی شدند. برای اطمینان از اینکه سیگنال احتمالی وارئه‌های مخرب نادر در ADHD توسط نرخ کلی وارئه‌ها در نمونه‌های iPSYCH هدایت نشده است، فقط ژن‌هایی که نرخ وارئه‌های سینونیم نادر در افراد کنترل بیشتر از ADHD بود، وارد تحلیل شد (۱۵٬۶۰۳ ژن مورد بررسی؛ ۳٬۲۶۳ ژن حذف شد).

ما تست باری مبتنی بر ژن را برای شناسایی ژن‌های دارای بار افزایشی وارئه‌های کلاس I یا کلاس II با استفاده از آزمون دقیق فیشر دو‑طرفه انجام دادیم. از آنجا که تمرکز ما بر وارئه‌های با اثر مخرب بر عملکرد پروتئین بود، انتظار داشتیم این‌ها در ADHD نسبت به کنترل‌ها افزایش یابند. بنابراین و به‌علت استراتژی فیلترینگ وارئه‌ها (روش‌ها)، تحلیل محدود به ژن‌هایی شد که نرخ وارئه‌های کلاس I در ADHD بیشتر از کنترل‌ها داشت (۳٬۶۹۸ ژن) و/یا وارئه‌های کلاس II (۱٬۰۲۶ ژن) نسبت به افراد کنترل. برای ژن‌هایی که هر دو وارئه کلاس I و کلاس II را داشتند (۳۴۷ ژن)، اثر ترکیبی این وارئه‌ها را با متاآنالیز روش وزن‌دار z‑score تخمین زدیم. در مجموع، ۱۵٬۶۰۳ ژن تست شد (۳۴۷ ژن سه‌بار تست شد) که منجر به ۱۶٬۲۹۷ تست شد. ما ژنی را به عنوان مرتبط به‌طور معنادار با ADHD در نظر می‌گیریم اگر مقدار P کمتر از ۰.۰۵/۱۶٬۲۹۷ = ۳.۰۷ × 10⁻⁶ باشد.

ما سه ژن معنادار برای ADHD شناسایی کردیم (MAP1A، ANO8 و ANK2) (شکل 2a و جدول تکمیلی 4). نتایج برای MAP1A و ANO8 به‌طور کامل توسط وارئه‌های کلاس I (فقط rPTVs) هدایت شد؛ برای ANK2، نتیجه از هر دو وارئه کلاس I و کلاس II (rPTVs و rModerateDMVs) حاصل شد. جزئیات درباره فنوتیپ‌های افراد با وارئه‌های کلاس I یا کلاس II در این سه ژن ریسک در اطلاعات تکمیلی و شکل تکمیلی 5 یافت می‌شود. نسبت‌های شانس نشان می‌دهند که وارئه‌های مخرب نادر در این ژن‌ها ریسک بسیار بالاتری نسبت به وارئه‌های رایج دارند^12,13، و بالاتر از خطرات مرتبط با تغییرات تعداد نسخه (CNVs) در iPSYCH^23,24 و سایر مطالعات²⁵ (شکل 2b). از بین ۲۰ ژن برتر (P < 1 × 10⁻³؛ جدول تکمیلی 4)، ۱۶ ژن محدود هستند.

a، نمودار ماندهتن با −log₁₀(P) در محور y برای ارتباطات مبتنی بر ژن از آزمون دقیق فیشر دو‑طرفه شمارش وارئه‌های کلاس I و II در ۸٬۸۹۵ فرد با ADHD و ۵۳٬۷۸۰ کنترل. موقعیت کروموزومی ژن‌ها در محور x نشان داده شده است. ژن‌هایی که آستانه معنی‌داری سراسری اگزوم (دو‑طرفه P < 3.07 × 10⁻⁶، که تصحیح برای ۱۶٬۲۹۷ تست را نشان می‌دهد) را برآورده می‌کردند، با رنگ قرمز تیره برجسته شدند؛ ژن‌هایی با P دو‑طرفه < 0.001 به رنگ نارنجی نمایش داده شدند. خط نقطه‌دار قرمز نشان‌دهنده معنی‌داری سراسری اگزوم است؛ خط نقطه‌دار آبی نمایانگر P دو‑طرفه ≤ 0.001 است. b، نمودار معماری ژنتیکی. نقاط نشان‌دهنده ORهای این مطالعه و آخرین GWAS¹³ و مطالعه CNV²⁵ ADHD هستند. فراوانی آلل کوچک در گروه‌های کنترل در محور x نشان داده شده است. رنگ نقطه نشان‑دهنده نوع وارئه (نادر، رایج یا CNV) و اندازه نقطه قدرت ارتباط را نشان می‌دهد. ۲۰ ژن این مطالعه با P‑بُرد دو‑طرفه < 0.001 در رنگ قرمز نشان داده شده‌اند؛ ژن‌های معنی‌دار سراسری اگزوم با رنگ قرمز پر و بقیه با رنگ قرمز شفاف. دو ژن (WNT1 و EIF3G) دارای OR نامحدود هستند، زیرا وارئه‌های مخرب نادر تنها در افراد ADHD مشاهده شد و در افراد کنترل هیچ وارئه‌ای وجود نداشت.

قابلیت تعمیم یافته‌های ما در یک نمونه اروپایی دیگر، شامل ۱٬۰۷۸ فرد که به‌طور بالینی تشخیص ADHD مداوم داشتند و ۱٬۷۳۸ کنترل، بررسی شد. به‌طور کلی، وارئه‌های کلاس I به‌صورت معناداری در ADHD غنی‌سازی شد، و غنی‌سازی بیشتر هنگام محدود کردن به ژن‌های محدود (OR = 1.24، CI = [1.07، 1.45]، P = 0.005؛ شکل تکمیلی 6 و جدول تکمیلی 5). به‌دلیل اندازه نمونه کوچک، توان کافی برای کشف ژن‌های معنادار نداشتیم، اما نقطه‌برآورد اثر برای مجموعه ژن برتر از تحلیل کشفی ما بالاتر از ژن‌های محدود بود (OR = 1.42، CI = [1.08، 1.85]، P = 0.012؛ جدول تکمیلی 6؛ همچنین به‌مطلق در اطلاعات تکمیلی) که نشان می‌دهد ژن‌های برتر شناسایی شده در مجموع ریسک بیشتری نسبت به ژن‌های محدود به ADHD می‌دهند. قابل‌ذکر است که تعداد وارئه‌های مخرب در MAP1A و ANK2 در افراد ADHD بالاتر از افراد کنترل بود (وارئه مخرب نادر در ANO8 مشاهده نشد؛ جدول تکمیلی 7).

تحلیل‌های کروموزوم X

تفاوت‌های معنادار در بار وارئه‌های مخرب بر روی کروموزوم X تنها برای وارئه‌های کلاس II در ADHD همراه با ID (شکل داده‌های گسترده 2a–d و جدول تکمیلی 8) نسبت به کنترل‌ها مشاهده شد؛ و در تحلیل جدولی‌سازی شده بر پایه جنس که افراد مرد مبتلا به ADHD را با افراد کنترل مقایسه می‌کرد (شکل تکمیلی 7)، نیز مشاهده شد، اما پس از حذف هم‌دوشی ID چنین تفاوتی نداشت. هیچ ژنی بر روی کروموزوم X پس از تصحیح بونفرونی با ADHD مرتبط نشد (جدول تکمیلی 9).

ارث‌پذیری بار وارئه نادر

پراکندگی فنوتیپ توضیح‌داده‌شده توسط وارئه‌های نادر، ارث‌پذیری بار وارئه‌ای ۲٫۵٪ (خطای معیار = ۰٫۷٪) برای وارئه‌های کلاس I و ۰٫۱٪ (خطای معیار = ۰٫۳٪) برای وارئه‌های کلاس II در ADHD بر مقیاس مسئولیت، با استفاده از شیوع جمعیتی ۵٪ (جدول تکمیلی 10) نشان داد. هنگام حذف هم‌دوشی ID، ارث‌پذیری بار به ۱٫۴۳٪ (خطای معیار = ۰٫۷۴٪) و ۰٫۲۶٪ (خطای معیار = ۰٫۲۷) برای وارئه‌های کلاس I و کلاس II به‑ترتیب کاهش یافت. این برآوردها با یافته‌های اسکیزوفرنی (۱٫۷٪ (خطای معیار = ۰٫۳٪)) و اختلال دوقطبی (۱٫۸٪ (خطای معیار = ۰٫۳٪))²⁶ هم‌راستا هستند. وارئه‌های سینونیم نادر شواهدی برای ارث‌پذیری بار غیر‑صفر در ADHD نشان ندادند. سه ژن معنادار (MAP1A، ANO8 و ANK2) ۵٫۲٪ (خطای معیار = ۳٫۴٪) از بار ارث‌پذیری کلاس I را توضیح دادند، که نشان می‌دهد ژن‌های خطر دیگر ADHD که توسط وارئه‌های کدینگی نادر شناسایی می‌شوند، هنوز باید کشف شوند.

اتصال ژن‌های خطر ADHD به زیست‌شناسی

سه ژن خطر شناسایی‌شده ممکن است به‌سوی مجموعه بزرگ‌تری از ژن‌ها و مکانیزم‌های زیستی مرتبط با ADHD هدایت کنند، همان‌طور که در سایر اختلالات گزارش شده است²⁷. برای بررسی این موضوع، ایمون‌پریسیپیتیشن‑ماس اسید (IP‑MS) برای پروتئین‌های رمزگذاری‌شده توسط این سه ژن (که از این پس به‌عنوان پروتئین‌های شاخص نامیده می‌شوند) در سلول‌های نواری عصبی مشتق‌شده از سلول‌های بنیادی القایی انسانی (iPS) و نورون‌های برانگیزشی (ExNs) انجام دادیم تا شبکه‌های PPI آن‌ها را تولید کنیم (جدول‌های تکمیلی PPI 1–5). در دو نوع سلول، به‌ترتیب ۱۸۴