واریانت‌های ژنتیکی نادر، خطر بالای ابتلا به ADHD را به همراه دارند و به نقش زیست‌شناسی عصبی اشاره می‌کنند

چکیده

اختلال کم‌توجهی-بیش‌فعالی (ADHD) یک اختلال عصبی-تحولی با شروع در دوران کودکی است که بخش بزرگی از آن ریشه ژنتیکی دارد^۱. این اختلال حدود ۵٪ از کودکان و ۲.۵٪ از بزرگسالان را تحت تأثیر قرار می‌دهد^۲ و با چندین پیامد شدید همراه است^{۳،۴،۵،۶،۷،۸،۹،۱۰،۱۱}. واریانت‌های ژنتیکی رایج مرتبط با این اختلال شناسایی شده‌اند^۱۲،۱۳، اما نقش واریانت‌های نادر در ADHD تا حد زیادی ناشناخته است. در این پژوهش، با تحلیل واریانت‌های کدکننده نادر در داده‌های توالی‌یابی کل اگزوم از ۸,۸۹۵ فرد مبتلا به ADHD و ۵۳,۷۸۰ فرد در گروه کنترل، سه ژن (MAP1A، ANO8 و ANK2؛ P < ۳.۰۷ × ۱۰^-۶؛ نسبت شانس ۵.۵۵-۱۵.۱۳) را شناسایی کردیم که در بروز ADHD نقش دارند. شبکه‌های برهمکنش پروتئین-پروتئین این سه ژن، غنی از ژن‌های پرخطر با واریانت نادر مرتبط با سایر اختلالات عصبی-تحولی و همچنین ژن‌های دخیل در سازماندهی اسکلت سلولی، عملکرد سیناپس و پردازش RNA بودند. ژن‌های پرخطری که بیشترین ارتباط را با واریانت‌های نادر داشتند، بیان فزاینده‌ای را در مراحل مختلف رشد مغز (پیش و پس از تولد) و در چندین نوع سلول عصبی، از جمله نورون‌های گابائرژیک (تولیدکننده گاما-آمینوبوتیریک اسید) و دوپامینرژیک، نشان دادند. واریانت‌های زیان‌آور با وضعیت اقتصادی-اجتماعی پایین‌تر و سطح تحصیلات کمتر در افراد مبتلا به ADHD مرتبط بودند و در نمونه‌ای از بزرگسالان مبتلا به ADHD (تعداد = ۹۶۲)، هر واریانت زیان‌آور نادر با کاهش ۲.۲۵ واحدی ضریب هوشی (IQ) همراه بود. افراد مبتلا به ADHD و کم‌توانی ذهنی، بار کلی بیشتری از واریانت‌های نادر را نشان دادند، در حالی که سایر همبودی‌های روانپزشکی تنها در مجموعه‌ ژن‌های خاص مرتبط با همان همبودی‌ها بار بیشتری داشتند. این یافته نشان می‌دهد که همبودی‌های روانپزشکی در ADHD عمدتاً ناشی از واریانت‌های نادر در ژن‌های خاص است، نه افزایش کلی بار واریانت‌ها در ژن‌های محافظت‌شده.

متن اصلی

اختلال کم‌توجهی-بیش‌فعالی (ADHD) یک اختلال عصبی-تحولی است که حدود ۵٪ از کودکان و ۲.۵٪ از بزرگسالان در سراسر جهان را تحت تأثیر قرار می‌دهد^۲. این اختلال با انواع پیامدهای جدی مرتبط است، از جمله خطر بالاتر اختلال مصرف مواد^۳،۴، حوادث^۵، مرگ زودهنگام^۶، بیکاری^۷، حبس و جرم^۸، خودکشی^۹ و بیماری‌های متابولیک^۱۰،۱۱. کسب بینش در مورد سازوکارهای بیولوژیکی محرک این اختلال برای درک چگونگی شکل‌گیری آن و یافتن راه‌های درمان در آینده بسیار حیاتی است.

بخش بزرگی از خطر ابتلا به ADHD را می‌توان به عوامل ژنتیکی نسبت داد، به طوری که وراثت‌پذیری تخمینی در دوقلوها بین ۷۷ تا ۸۸ درصد است^۱. مطالعات گسترده همبستگی سراسر ژنوم (GWAS) نشان داده‌اند که واریانت‌های ژنتیکی رایج، ۱۴ تا ۲۲ درصد از کل تنوع در استعداد ابتلا را توضیح می‌دهند^۱۲،۱۳. جدیدترین مطالعه GWAS در مورد ADHD، بیست و هفت جایگاه ژنی معنادار در سطح ژنوم را شناسایی کرد و تخمین زد که حدود ۷,۳۰۰ واریانت رایج، ۹۰ درصد از وراثت‌پذیری ناشی از پلی‌مورفیسم تک‌نوکلئوتیدی (SNP) برای ADHD را تشکیل می‌دهند^۱۳. بنابراین، ADHD اختلالی بسیار چندژنی است و بخش قابل‌توجهی از خطر آن توسط تنوع ژنتیکی رایج توضیح داده می‌شود؛ با این حال، برای توضیح بخش بیشتری از وراثت‌پذیری، بررسی واریانت‌های نادر نیز ضروری است. ما پیش از این ثابت کرده‌ایم که واریانت‌های زیان‌آور نادر در ژن‌های محافظت‌شده از نظر تکاملی، نقشی در ADHD دارند که با آنچه در اوتیسم یافت شده، قابل مقایسه است^۱۴.

اگرچه واریانت‌های کدکننده نادر ممکن است تنها بخش کوچکی از کل استعداد ابتلا را توضیح دهند، اما هر یک به تنهایی می‌توانند خطر قابل‌توجهی ایجاد کنند و برخلاف واریانت‌های رایج، اغلب به طور مستقیم به ژن عامل و پیامد عملکردی احتمالی آن اشاره می‌کنند و سرنخ‌هایی از علت‌شناسی زمینه‌ای ADHD ارائه می‌دهند.

در اینجا نتایج یک مطالعه توالی‌یابی کل اگزوم در مورد ADHD را ارائه می‌دهیم و سه ژن معنادار را شناسایی می‌کنیم که در افراد مبتلا به ADHD در مقایسه با افراد گروه کنترل، بار بیشتری از واریانت‌های زیان‌آور نادر دارند. ما با پیوند دادن ژن‌های پرخطر شناسایی‌شده با داده‌های بیان ژن از بافت‌ها و انواع سلول‌های مغز و از طریق تحلیل شبکه‌های برهمکنش پروتئین-پروتئین (PPI) این ژن‌ها، بینش‌هایی در مورد معماری ژنتیکی و سازوکارهای نوروبیولوژیکی دخیل در ADHD ارائه می‌دهیم. ما همچنین بار واریانت‌های زیان‌آور نادر را در میان همبودی‌های مختلف ارزیابی کرده و نشان می‌دهیم که این واریانت‌ها بر وضعیت اقتصادی-اجتماعی (SES) و شناخت در افراد مبتلا به ADHD تأثیر می‌گذارند.

توالی‌یابی افراد از گروه iPSYCH

ما داده‌های توالی‌یابی کل اگزوم را از ۸,۸۹۵ فرد مبتلا به ADHD و ۹,۰۰۱ فرد گروه کنترل از پروژه دانمارکی iPSYCH^۱۵،۱۶ (بخش روش‌ها، جدول تکمیلی ۱ و شکل توسعه‌یافته داده‌ها ۱) تجزیه و تحلیل کردیم که حجم نمونه را نسبت به مطالعه قبلی ما^۱۴ دو برابر می‌کند.

ما بر روی واریانت‌های نادر با فراوانی آللی حداکثر پنج در کل گروه iPSYCH (۱۷,۸۹۶ نفر؛ شکل‌های تکمیلی ۱ و ۲) و زیرمجموعه‌ای از افراد با تبار اروپایی (غیرفنلاندی) از پایگاه داده Genome Aggregation Database (gnomAD) که هیچ اختلال روانپزشکی در آن‌ها تشخیص داده نشده بود^۱۷ (۴۴,۷۷۹ نفر)، تمرکز کردیم. در میان افراد مورد مطالعه، همبودی بالایی با کم‌توانی ذهنی (ID) وجود داشت (۱۸.۴٪؛ جدول تکمیلی ۱) و در نتیجه، تأثیر هم‌زمان ID با انجام تحلیل‌ها هم با و هم بدون ID همبود ارزیابی شد.

اثرات در دسته‌های عملکردی مختلف

واریانت‌های نادر بر اساس تأثیر عملکردی‌شان بر پروتئین کدشده گروه‌بندی شدند و بار آن‌ها در افراد مبتلا به ADHD در مقایسه با افراد گروه کنترل برای تمام ژن‌های اتوزومی (۱۸,۸۶۶ ژن) و ژن‌های اتوزومی با احتمال عدم تحمل به از دست دادن عملکرد (pLI) ≥ ۰.۹ (۲,۸۱۱ ژن)^۱۸ ارزیابی شد که از این پس به آن‌ها ژن‌های محافظت‌شده می‌گوییم. ما بار به‌طور قابل‌توجهی بالاتری از واریانت‌های کوتاه‌کننده پروتئین نادر (rPTVs) را در افراد مبتلا به ADHD نسبت به افراد گروه کنترل در تمام ژن‌ها یافتیم (نسبت شانس (OR) = ۱.۰۶، فاصله اطمینان ۹۵٪ (CI) = [۱.۰۴, ۱.۰۸]، P = ۲.۴۱ × ۱۰^-۷) و این بار در ژن‌های محافظت‌شده حتی بیشتر بود (OR = ۱.۳۵، CI = [۱.۲۶, ۱.۴۵]، P = ۱.۵۲ × ۱۰^-۱۷؛ شکل 1a و جدول تکمیلی ۲). مطابق با مشاهدات در اسکیزوفرنی^۱۹، اندازه اثر دوم مشابه چیزی بود که برای واریانت‌های بدمعنی به‌شدت آسیب‌رسان نادر (rSevereDMVs؛ تعریف شده به عنوان واریانت‌هایی با امتیاز MPC^۲۰ > ۳) در تمام ژن‌ها مشاهده شد (OR = ۱.۲۹، CI = [۱.۰۹, ۱.۵۴]، P = ۴.۱۱ × ۱۰^-۳؛ شکل 1a و جدول تکمیلی ۲). در نتیجه، rPTVs و rSevereDMVs در تحلیل کشف ژن با هم گروه‌بندی شدند (تحت عنوان واریانت‌های کلاس I). بار واریانت‌های بدمعنی نادر با تأثیر متوسط پیش‌بینی‌شده بر عملکرد پروتئین (rModerateDMVs؛ 2 ≤ MPC score ≤ 3) در ADHD به طور قابل‌توجهی افزایش یافته بود، اما با اندازه اثر کمتر (OR_{all_genes} = ۱.۱۱، CI = [۱.۰۷, ۱.۱۶]، P = ۱.۴۳ × ۱۰^-۸؛ شکل 1a و جدول تکمیلی ۲) نسبت به آنچه برای واریانت‌های کلاس I مشاهده شد؛ بنابراین این‌ها به طور جداگانه تحلیل شدند (تحت عنوان واریانت‌های کلاس II). برای مقایسه، هیچ افزایش باری از واریانت‌های مترادف نادر در ADHD در ژن‌های محافظت‌شده مشاهده نشد (شکل 1a).

الف، نسبت شانس (OR) برای rPTVs، rSevereDMVs، rModerateDMVs و واریانت‌های مترادف نادر (rSYNs) در تمام ژن‌ها (با رنگ زرد مشخص شده) و در ژن‌های محافظت‌شده (pLI ≥ ۰.۹؛ با رنگ قرمز مشخص شده) در افراد مبتلا به ADHD (تعداد = ۸,۸۹۵) و افراد گروه کنترل (تعداد = ۹,۰۰۱). نقاط، تخمین‌های نقطه‌ای OR را نشان می‌دهند و نوارهای خطا، فواصل اطمینان ۹۵٪ (CIs) مربوطه را نشان می‌دهند. به دلیل اندازه‌های اثر مشابه rPTVs و rSevereDMVs در ژن‌های محافظت‌شده (pLI ≥ ۰.۹)، این واریانت‌ها در کلاس I گروه‌بندی شدند و rModerateDMVs به عنوان واریانت‌های کلاس II طبقه‌بندی شدند. توجه: تعداد rSYNs در هر فرد به عنوان یک متغیر کمکی در تحلیل‌ها استفاده می‌شود و بنابراین، آزمون تفاوت در بار rSYN در تمام ژن‌های اتوزومی امکان‌پذیر نیست. ب، میانگین تعداد واریانت‌های کلاس I (rPTVs + rSevereDMVs) در ژن‌های محافظت‌شده (pLI ≥ ۰.۹) به ازای هر فرد. ADHD: افراد مبتلا به ADHD بدون در نظر گرفتن هرگونه همبودی؛ ADHDwoID: افراد مبتلا به ADHD اما بدون ID؛ ADHDwID: افراد مبتلا به هر دو اختلال ADHD و ID. نسبت‌های شانس و مقادیر P دوطرفه با استفاده از رگرسیون لجستیک در الف و ب محاسبه شده‌اند.

واریانت‌های کلاس I در ژن‌های محافظت‌شده تقریباً در یک نفر از هر پنج فرد مبتلا به ADHD شناسایی شد (شکل 1b، جدول تکمیلی ۳ و شکل تکمیلی ۳)، که نشان می‌دهد واریانت‌های بسیار زیان‌آور در اکثر افراد مبتلا به ADHD در خطر بیماری نقش نداشته‌اند.

هیچ تفاوتی در بار واریانت‌ها بین مردان و زنان مبتلا به ADHD مشاهده نشد (شکل تکمیلی ۴)، که نشان می‌دهد بار کلی واریانت‌های نادر در دو جنس مشابه است، مطابق با آنچه برای واریانت‌های رایج مشاهده شده است^۲۱،۲۲.

کشف ژن‌های مرتبط با ADHD

برای افزایش قدرت شناسایی ژن‌های پرخطر با واریانت نادر برای ADHD، گروه کنترل با ترکیب کنترل‌های iPSYCH با ۴۴,۷۷۹ فرد از gnomAD^۱۷ گسترش یافت. در مجموع، ما ۸,۸۹۵ فرد مبتلا به ADHD و ۵۳,۷۸۰ فرد گروه کنترل را تحلیل کردیم و تنها مناطق ژنومی با داده‌های باکیفیت در هر دو نمونه iPSYCH و gnomAD را ارزیابی کردیم. برای اطمینان از اینکه سیگنال احتمالی واریانت‌های زیان‌آور نادر در ADHD ناشی از نرخ کلی بالاتر واریانت‌ها در نمونه‌های iPSYCH نیست، ما فقط ژن‌هایی را شامل کردیم که نرخ واریانت‌های مترادف نادر در افراد گروه کنترل بالاتر از افراد مبتلا به ADHD بود (۱۵,۶۰۳ ژن تحلیل شد؛ ۳,۲۶۳ ژن حذف شد).

ما یک آزمون بار مبتنی بر ژن را برای شناسایی ژن‌هایی با بار افزایش‌یافته از واریانت‌های کلاس I یا کلاس II با استفاده از آزمون دقیق فیشر دوطرفه انجام دادیم. از آنجا که ما بر روی واریانت‌هایی با تأثیر زیان‌آور بر عملکرد پروتئین تمرکز داشتیم، انتظار داشتیم که این واریانت‌ها در افراد مبتلا به ADHD در مقایسه با گروه کنترل افزایش یافته باشند. بنابراین، و به دلیل استراتژی فیلتر کردن واریانت‌های ما (بخش روش‌ها)، تحلیل به ژن‌هایی با نرخ بالاتر واریانت‌های کلاس I (۳,۶۹۸ از ۱۵,۶۰۳ ژن) یا واریانت‌های کلاس II (۱,۰۲۶ از ۱۵,۶۰۳ ژن) در ADHD نسبت به گروه کنترل محدود شد. برای ژن‌هایی که هم واریانت‌های کلاس I و هم کلاس II داشتند (۳۴۷ ژن)، نیاز بود که تعداد هر دو نوع واریانت در ADHD بیشتر از گروه کنترل باشد و اثر ترکیبی در یک فراتحلیل تخمین زده شد (بخش روش‌ها).

ما سه ژن معنادار را شناسایی کردیم: MAP1A (P = ۱.۰۲ × ۱۰^-۶، OR = ۱۳.۳۱)، ANO8 (P = ۱.۹۰ × ۱۰^-۶، OR = ۱۵.۳۱) و ANK2 (P = ۲.۷۲ × ۱۰^-۶، OR = ۵.۵۵) (شکل 2a و جدول تکمیلی ۴). نتایج برای MAP1A و ANO8 کاملاً ناشی از واریانت‌های کلاس I (فقط rPTVs) بود؛ برای ANK2، نتیجه از هر دو واریانت کلاس I و کلاس II (rPTVs و rModerateDMVs) نشأت می‌گرفت. جزئیات مربوط به فنوتیپ‌های افرادی که دارای واریانت‌های کلاس I یا II در سه ژن پرخطر بودند در اطلاعات تکمیلی و شکل تکمیلی ۵ قابل مشاهده است. نسبت‌های شانس (ORs) نشان دادند که واریانت‌های زیان‌آور نادر در این ژن‌ها خطری بسیار بالاتر از آنچه برای واریانت‌های رایج مشاهده شده است^۱۲،۱۳ و بالاتر از خطرات مشاهده‌شده برای واریانت‌های تعداد کپی (CNVs) در iPSYCH^۲۳،۲۴ و سایر مطالعات^۲۵ ایجاد می‌کنند (شکل 2b). از ۲۰ ژن برتر (P < ۱ × ۱۰^-۳؛ جدول تکمیلی ۴)، ۱۶ ژن از نوع محافظت‌شده هستند.

الف، نمودار منهتن با مقدار −log_۱۰(P) روی محور y برای همبستگی‌های مبتنی بر ژن از آزمون دقیق فیشر دوطرفه بر روی تعداد واریانت‌های نادر کلاس I و II در ۸,۸۹۵ فرد مبتلا به ADHD و ۵۳,۷۸۰ فرد گروه کنترل. موقعیت کروموزومی ژن‌ها روی محور x نشان داده شده است. ژن‌هایی که به آستانه معناداری سراسر اگزوم رسیده‌اند (P دوطرفه < ۳.۰۷ × ۱۰^-۶، که به معنای معناداری پس از تصحیح برای ۱۶,۲۹۷ آزمون است) با رنگ قرمز تیره مشخص شده‌اند؛ ژن‌های با P دوطرفه < ۰.۰۰۱ با رنگ نارنجی نشان داده شده‌اند. خط چین قرمز نشان‌دهنده معناداری سراسر اگزوم است؛ خط چین آبی نشان‌دهنده P دوطرفه ≤ ۰.۰۰۱ است. ب، نمودار معماری ژنتیکی. نقاط نشان‌دهنده نسبت‌های شانس (ORs) از این مطالعه و جدیدترین مطالعات GWAS^۱۳ و CNV^۲۵ در مورد ADHD هستند. فراوانی آلل مینور در گروه‌های کنترل روی محور x نشان داده شده است. رنگ نقاط نوع واریانت (نادر، رایج یا CNV) را نشان می‌دهد و اندازه نقاط بازتاب‌دهنده قدرت همبستگی‌هاست. ۲۰ ژن از این مطالعه با P بار مبتنی بر ژن دوطرفه < ۰.۰۰۱ با رنگ قرمز نشان داده شده‌اند؛ ژن‌های معنادار در سطح سراسر اگزوم به رنگ قرمز یکدست و بقیه به رنگ قرمز نیمه‌شفاف هستند. دو ژن (WNT1 و EIF3G) دارای نسبت شانس بی‌نهایت هستند، زیرا واریانت‌های زیان‌آور نادر تنها در افراد مبتلا به ADHD و نه در افراد گروه کنترل مشاهده شدند.

ما قابلیت تعمیم یافته‌های خود را در یک نمونه اروپایی دیگر، متشکل از ۱,۰۷۸ فردی که به طور بالینی مبتلا به ADHD پایدار تشخیص داده شده بودند و ۱,۷۳۸ فرد کنترل، بررسی کردیم. به طور کلی، واریانت‌های کلاس I به طور قابل توجهی در ADHD غنی شده بودند و این غنی‌سازی هنگام محدود کردن به ژن‌های محافظت‌شده بیشتر بود (OR = ۱.۲۴، CI = [۱.۰۷, ۱.۴۵]، P = ۰.۰۰۵؛ شکل تکمیلی ۶ و جدول تکمیلی ۵). به دلیل حجم کوچک نمونه، ما قدرت کشف ژن‌های معنادار را نداشتیم، اما تخمین نقطه‌ای اندازه اثر برای مجموعه ژن‌های برتر از تحلیل اکتشافی ما بالاتر از ژن‌های محافظت‌شده بود (OR = ۱.۴۲، CI = [۱.۰۸, ۱.۸۵]، P = ۰.۰۱۲؛ جدول تکمیلی ۶؛ همچنین به اطلاعات تکمیلی مراجعه کنید)، که نشان می‌دهد ژن‌های برتر شناسایی‌شده در مجموع خطر بیشتری برای ADHD نسبت به ژن‌های محافظت‌شده ایجاد می‌کنند. قابل ذکر است که تعداد واریانت‌های زیان‌آور در MAP1A و ANK2 در افراد مبتلا به ADHD بیشتر از افراد گروه کنترل بود (هیچ واریانت زیان‌آور نادری در ANO8 مشاهده نشد؛ جدول تکمیلی ۷).

تحلیل‌های کروموزوم X

تفاوت‌های معنادار در بار واریانت‌های زیان‌آور روی کروموزوم X فقط برای واریانت‌های کلاس II در افراد مبتلا به ADHD همراه با ID مشاهده شد (شکل توسعه‌یافته داده‌ها 2a-d و جدول تکمیلی ۸)، در مقایسه با گروه کنترل، و در تحلیل تفکیک‌شده بر اساس جنسیت، هنگام مقایسه مردان مبتلا به ADHD با گروه کنترل (شکل تکمیلی ۷)، اما پس از حذف ID همبود، این تفاوت‌ها معنادار نبودند. هیچ ژنی روی کروموزوم X پس از تصحیح بونفرونی با ADHD مرتبط نبود (جدول تکمیلی ۹).

وراثت‌پذیری بار نادر

تغییرپذیری در فنوتیپ که توسط واریانت‌های نادر توضیح داده می‌شود، وراثت‌پذیری بار ۲.۵٪ (خطای استاندارد = ۰.۷٪) برای واریانت‌های کلاس I و ۰.۱٪ (خطای استاندارد = ۰.۳٪) برای واریانت‌های کلاس II برای ADHD در مقیاس استعداد ابتلا را نشان داد، با استفاده از شیوع جمعیتی ۵٪ (جدول تکمیلی ۱۰). هنگام حذف ID همبود، وراثت‌پذیری بار به ترتیب به ۱.۴۳٪ (خطای استاندارد = ۰.۷۴٪) و ۰.۲۶٪ (خطای استاندارد = ۰.۲۷) برای واریانت‌های کلاس I و کلاس II کاهش یافت. این تخمین‌ها با یافته‌های مربوط به اسکیزوفرنی (۱.۷٪ (خطای استاندارد = ۰.۳٪)) و اختلال دوقطبی (۱.۸٪ (خطای استاندارد = ۰.۳٪)) مطابقت دارد^۲۶. واریانت‌های مترادف نادر هیچ شواهدی از وراثت‌پذیری بار غیرصفر برای ADHD نشان ندادند. سه ژن معنادار (MAP1A، ANO8 و ANK2) ۵.۲٪ (خطای استاندارد = ۳.۴٪) از وراثت‌پذیری بار کلاس I را توضیح دادند، که نشان می‌دهد ژن‌های پرخطر دیگری برای ADHD که توسط واریانت‌های کدکننده نادر تحت تأثیر قرار می‌گیرند، هنوز باید شناسایی شوند.

پیوند ژن‌های پرخطر ADHD با زیست‌شناسی

سه ژن پرخطر شناسایی‌شده ممکن است از طریق شرکای برهمکنش پروتئینی خود به مجموعه بزرگ‌تری از ژن‌ها و سازوکارهای بیولوژیکی دخیل در ADHD اشاره کنند، همان‌طور که در سایر اختلالات گزارش شده است^۲۷. برای بررسی این موضوع، ما ایمیونورسیپیتاسیون-طیف‌سنجی جرمی (IP-MS) را برای پروتئین‌های کدشده توسط این سه ژن (از این پس پروتئین‌های شاخص نامیده می‌شوند) در سلول‌های پیش‌ساز عصبی (NPCs) و نورون‌های تحریکی (ExNs) مشتق از سلول‌های بنیادی پرتوان القایی انسانی (iPS) انجام دادیم تا شبکه‌های برهمکنش پروتئین-پروتئین (PPI) آن‌ها را تولید کنیم (جداول تکمیلی PPI ۱-۵). در این دو نوع سلول، ما به ترتیب ۱۸۴، ۳۵ و ۱۵۸ شریک برهمکنش برای MAP1A، ANO8 و ANK2 شناسایی کردیم؛ ۳۶ مورد به بیش از یک پروتئین شاخص مرتبط بودند و بنابراین می‌توانند به زیست‌شناسی همگرا اشاره کنند (شکل 3a-d). از پروتئین‌های در حال برهمکنش، ۴۸ مورد قبلاً در مطالعات ژنتیکی با اختلالات عصبی-تحولی مرتبط شده‌اند^{۱۳،۱۹،۲۸} (جدول تکمیلی PPI ۶). علاوه بر این، شبکه‌های MAP1A، ANK2 و شبکه ترکیبی هر سه پروتئین شاخص به طور معناداری (نرخ کشف نادرست (FDR) < ۰.۰۵، آزمون‌های کولموگروف-اسمیرنوف یک‌طرفه) برای ژن‌های پرخطر با واریانت نادر مرتبط با اختلال طیف اوتیسم (ASD) و اختلالات رشدی (DDs) در هر دو سلول NPC و ExN، در مقایسه با سایر ژن‌های کدکننده پروتئین بیان‌شده در مدل سلول عصبی، غنی‌سازی شده بودند (شکل 3e و جداول تکمیلی PPI ۷ و ۸). شبکه ANO8 برای ژن‌های پرخطر با واریانت نادر مرتبط با DD و اسکیزوفرنی در ExN غنی‌سازی شده بود. این شبکه‌ها برای ژن‌های پرخطر ADHD یا سایر ژن‌های پرخطر عصبی-تحولی شناسایی‌شده توسط واریانت‌های رایج، غنی‌سازی نشده بودند (جدول تکمیلی PPI ۹).

الف، شبکه PPI مشتق از سه آزمایش IP-MS. گره‌ها نشان‌دهنده پروتئین‌های شاخص (MAP1A، ANK2 و ANO8) و برهمکنش‌گرهای آن‌ها (بنفش) هستند؛ شدت رنگ و اندازه گره‌های برهمکنش‌گر با فراوانی برهمکنش‌گر (یعنی تعداد پروتئین‌های شاخص مرتبط) مقیاس‌بندی می‌شود. رنگ خط نوع سلول را نشان می‌دهد: NPCs به رنگ آبی، ExNs به رنگ سبز و هر دو نوع سلول به رنگ نارنجی. ب، توزیع فراوانی برهمکنش‌گر در شبکه. ج، توزیع برهمکنش‌های InWeb در مقابل برهمکنش‌های جدید گزارش‌شده در شبکه. د، توزیع برهمکنش‌ها در انواع سلول‌ها. ه، نتایج آزمون‌های کولموگروف-اسمیرنوف یک‌طرفه برای غنی‌سازی در شبکه‌های PPI از ژن‌های پرخطر با واریانت نادر مرتبط با اوتیسم (ASD)^۲۸، اختلالات رشدی (DDs)^۲۸ یا اسکیزوفرنی (SCZ)^۱۹. *آزمون کولموگروف-اسمیرنوف یک‌طرفه P < ۰.۰۵، **FDR < ۰.۰۵، حداقل P برای اهداف نمایشی در ۱ × ۱۰^-۱۵ محدود شده است. نتایج برای تمام ژن‌های دارای امتیاز pLI^۴۸ (همه)، ژن‌های محافظت‌شده (pLI ≥ ۰.۹) و ژن‌های غیرمحافظت‌شده (pLI < ۰.۹) به طور جداگانه نشان داده شده‌اند.

علاوه بر این، بیشتر شبکه‌ها به شدت برای پروتئین‌های کدشده توسط ژن‌های محافظت‌شده غنی‌سازی شده بودند (جدول تکمیلی PPI ۸). ژن‌های شبکه محافظت‌شده به طور کلی در مقایسه با سایر ژن‌های محافظت‌شده، غنی‌سازی بیشتری برای خطرات بیماری نشان ندادند، در حالی که ژن‌های غیرمحافظت‌شده در برخی شبکه‌ها در مقایسه با بقیه ژنوم غیرمحافظت‌شده، غنی‌سازی قوی‌تری نشان دادند (شکل 3e و جدول تکمیلی PPI ۱۰).

برای هر یک از سه پروتئین شاخص، ژن‌های شبکه PPI ترکیبی (NPCs + ExNs) به طور قابل توجهی در چندین مجموعه ژنی غنی بودند. برای MAP1A، یافته‌های برتر شامل ژن‌های کدکننده پروتئین‌های متصل‌شونده به RNA (P = ۲.۳۲ × ۱۰^-۹۹) و پروتئین‌های ریبوزومی سیتوپلاسمی (P = ۲.۰۹ × ۱۰^-۸۵) بود؛ برای ANO8، ژن‌های بیان‌شده در اتصالات سلولی (P = ۲.۲۳ × ۱۰^-۱۱) و سیناپس‌ها (P = ۷.۰۹ × ۱۰^-۸)؛ و برای ANK2، ژن‌های کدکننده اسکلت سلولی اکتین (P = ۲.۷۷ × ۱۰^-۳۹) و پروتئین‌های اتصال سلولی (P = ۱.۱۷ × ۱۰^-۳۰) (جدول تکمیلی ۱۱). برای هر سه شبکه PPI، نسبت بالایی از ژن‌ها با ژن‌های دارای حاشیه‌نویسی سیناپسی در SynGO^۲۹ مطابقت داشتند (MAP1A ۵۲.۷٪؛ ANK2 ۴۴.۳۰٪؛ و ANO8 ۵۷.۱۴٪) و غنی‌سازی قابل توجهی را در میان ژن‌های دخیل در چندین فرآیند سیناپسی نشان دادند (جدول تکمیلی ۱۱). این امر به ویژه برای شبکه PPI MAP1A صادق بود، که در آن ۳۷ و ۴۹ ژن (از ۱۸۴ ژن) به ترتیب به عملکردهای پیش‌سیناپسی و پس‌سیناپسی مرتبط بودند (P_{presynaptic ribosome} = ۳.۰۲ × ۱۰^-۵۱؛ P_{postsynaptic ribosome} = ۶.۹۴ × ۱۰^-۶۸).

علاوه بر این، ۲۰ ژن پرخطر برتر ADHD در میان ژن‌های بیان‌شده در آکسون اصلی (P = ۴.۸ × ۱۰^-۷) و قطعه اولیه آکسون (P = ۱.۴ × ۱۰^-۶) و همچنین در میان ژن‌های دخیل در کانالوپاتی‌ها (P = ۲.۴ × ۱۰^-۷) غنی بودند.

از آنجا که ADHD دارای یک جزء خطر از واریانت‌های رایج است که ژن‌های بیان‌شده در مغز را تحت تأثیر قرار می‌دهد^۱۳، ما بیان ژن‌های پرخطر با واریانت نادر را در مراحل رشد مغز نئوکورتیکال با استفاده از داده‌های BrainSpan ارزیابی کردیم (بخش «دسترسی به داده‌ها» را ببینید). ژن‌های پرخطر ADHD در ۱۱ مرحله از ۱۲ مرحله رشد مغز (از پیش از تولد تا بزرگسالی) در مقایسه با میانگین بیان ژن‌ها، و در ۱۰ مرحله از ۱۲ مرحله در مقایسه با ژن‌های بیان‌شده در نورون‌ها، میانگین بیان به طور قابل توجهی بالاتری داشتند (جدول تکمیلی ۱۲، شکل 4a و شکل تکمیلی ۸). این در تضاد با ژن‌های پرخطر با واریانت رایج است که تنها در میان ژن‌های بیان‌شده پیش از تولد غنی بودند^۱۳.

الف، میانگین بیان، به صورت ln(خوانش در هر کیلوباز میلیون (RPKM) + ۱)، از ۱۷ ژن پرخطر ADHD و ژن‌های پس‌زمینه در مراحل رشد مغز نئوکورتیکال در BrainSpan. ژن‌های پس‌زمینه (۲۲,۴۰۲ ژن یا رونوشت) شامل ژن‌های بیان‌شده در BrainSpan، به جز ۱۷ ژن پرخطر ADHD، هستند. ستاره‌ها نشان‌دهنده تفاوت معنادار بین دو مجموعه ژن در یک مرحله رشد معین با استفاده از آزمون t زوجی دوطرفه یا آزمون رتبه ویلکاکسون هستند؛ P = ۴.۱۷ × ۱۰^-۳ پس از تصحیح برای ۱۲ مرحله رشد مغز، معنادار در نظر گرفته شد. خطوط عمودی نشان‌دهنده خطای استاندارد هستند. ب، بیان سه ژن معنادار در مراحل رشد مغز و بیان ژن‌های پس‌زمینه (۲۲,۴۱۶ ژن یا رونوشت). ستاره‌های کنار نام ژن‌ها در سمت راست نشان‌دهنده تفاوت‌های معنادار در میانگین بیان پیش و پس از تولد با استفاده از آزمون t دو نمونه‌ای دوطرفه هستند؛ P = ۲.۲ × ۱۰^-۱۶ (MAP1A) و P = ۲.۲ × ۱۰^-۱۶ (ANO8)؛ P دوطرفه = ۱.۶۷ × ۱۰^-۲ پس از تصحیح برای سه مقایسه، معنادار در نظر گرفته شد. خطوط عمودی نشان‌دهنده خطای استاندارد هستند. حجم نمونه برای هر مرحله رشد مغز نئوکورتیکال در جدول تکمیلی ۱۲ آمده است. ج، بالا، نمایش تقریب و تصویر منیفولد یکنواخت (UMAP) از داده‌های scRNA-seq^۳۲ که خوشه‌بندی انواع سلول‌ها از کشت‌های سلول iPS انسانی توسعه‌یافته به سمت انواع سلول‌های عصبی مغز میانی را نشان می‌دهد. نتایج برای سلول‌های توسعه‌یافته برای ۱۱، ۳۰ و ۵۲ روز نشان داده شده است: شبه‌آستروسیت (Astro)، نورون‌های دوپامینرژیک (DA)، شبه‌اپندیمال ۱ (Epen1)، شبه‌اپندیمال ۲ (Epen2)، پیش‌سازهای کف صفحه (FPP)، نوروبلاست‌ها (NB)، پیش‌سازهای تکثیرشونده کف صفحه (P_FPP)، نورون‌های شبه‌سروتونرژیک تکثیرشونده (P_Sert)، نورون‌های شبه‌سروتونرژیک (Sert)، نورون ناشناخته ۱ (U_Neur1)، نورون ناشناخته ۲ (U_Neur2) و نورون ناشناخته ۳ (U_Neur3). پایین، scDRS برای هر سلول، با شدت نشان‌داده‌شده توسط نوار در سمت راست. رنگ قرمز یا آبی به ترتیب نشان‌دهنده امتیاز مثبت یا منفی است که بیان افزایش‌یافته یا کاهش‌یافته ژن‌های پرخطر با واریانت نادر ADHD را در مقایسه با توزیع بیان مجموعه‌های ژن کنترل در یک سلول منعکس می‌کند.

به طور کلی، تفاوتی در میانگین بیان ژن‌های برتر پیش و پس از تولد وجود نداشت (P = ۰.۷۶)، اما MAP1A پس از تولد به طور قابل توجهی بیشتر از پیش از تولد بیان می‌شد (P = ۲.۲ × ۱۰^-۱۶) و برعکس آن برای ANO8 مشاهده شد (P = ۲.۲ × ۱۰^-۱۶؛ شکل 4b).

پیوند ژن‌های پرخطر ADHD با انواع سلول‌ها

از امتیازهای ارتباط بیماری در سطح تک‌سلولی (scDRSs)^۳۰ برای پیوند دادن ژن‌های پرخطر به انواع سلول‌ها استفاده شد. امتیاز scDRS بالاتر نشان‌دهنده انحراف قوی‌تر بیان ژن‌های پرخطر از بیان مجموعه‌های ژن کنترل در یک سلول است. واریانت‌های پرخطر رایج قبلاً با ژن‌هایی با بیان بالا در نورون‌های دوپامینرژیک در مغز میانی جنین انسان مرتبط شده‌اند^۱۳. در تحلیل‌های همان مجموعه داده توالی‌یابی RNA تک‌سلولی (scRNA-seq) از مغز میانی جنین انسان^۳۱، ما یک ارتباط معنادار (یعنی افزایش scDRS در یک نوع سلول) بین ژن‌های پرخطر با واریانت نادر و نورون‌های دوپامینرژیک طبقه‌بندی‌شده به عنوان نوع ۱ در مطالعه قبلی شناسایی کردیم (P = ۹.۹۹ × ۱۰^-۴)، که با یافته‌های واریانت‌های رایج سازگار است^۱۳. علاوه بر این، ما یک سیگنال معنادار برای نورون‌های گابائرژیک (P = ۹.۹۹ × ۱۰^-۴) و نوروبلاست‌های میانی (P = ۲ × ۱۰^-۳) یافتیم (شکل تکمیلی ۹ و جدول تکمیلی ۱۳). نتایج می‌توانست تحت تأثیر متغیرهایی باشد که ما قادر به تصحیح آن‌ها در این داده‌های قدیمی‌تر نبودیم (بخش روش‌ها)، و بنابراین ما یافته‌های خود را در یک مجموعه داده جدیدتر و بزرگ‌تر از انواع سلول‌های عصبی مغز میانی در حال رشد، مشتق از سلول‌های iPS انسانی^۳۲ که از ۲۱۵ اهداکننده سالم تولید شده بودند، تأیید کردیم. در اینجا ما یک scDRS به طور قابل توجهی افزایش‌یافته را هم در نورون‌های دوپامینرژیک ۳۰ روزه (P = ۹.۹۹ × ۱۰^-۴) و هم ۵۲ روزه (P = ۹.۹۹ × ۱۰^-۴) شناسایی کردیم (شکل 4c و جدول تکمیلی ۱۳).

ما همچنین scDRS را در ۳۸۲ خوشه از انواع سلول‌ها که طیفی از نورون‌های کل مغز انسان را نمایندگی می‌کنند^۳۳ بررسی کردیم، اما هیچ یافته معناداری نداشتیم (جدول تکمیلی ۱۳). در این مجموعه داده، خوشه نورون‌های دوپامینرژیک (scDRS P = ۰.۰۵۴)، سیگنال قوی مشاهده‌شده برای نورون‌های دوپامینرژیک مشتق از سلول‌های iPS را منعکس نکرد، که می‌تواند به دلیل تفاوت در سن نورون‌ها در مجموعه‌های داده باشد (نورون‌های مغزهای پس از مرگ^۳۳ در مقابل سلول‌های iPS^۳۲).

نتایج ما به شواهد رو به رشد مبنی بر اینکه واریانت‌های ژنتیکی پرخطر، هم رایج^۱۳ و هم نادر، از طریق تأثیر بر ژن‌های بیان‌شده در نورون‌ها، به ویژه نورون‌های گابائرژیک و مراحل جوان‌تر نورون‌های دوپامینرژیک، بر ADHD تأثیر می‌گذارند، می‌افزاید.

تأثیر بر پیامدهای اقتصادی-اجتماعی

در تحلیل‌های واریانت‌های رایج، یک همبستگی ژنتیکی منفی قوی بین ADHD و فنوتیپ‌های مرتبط با شناخت، از جمله پیشرفت تحصیلی، یافت شده است^۱۳. در اینجا ما ارتباط rPTVs در ژن‌های محافظت‌شده را با سطح تحصیلات و وضعیت اقتصادی-اجتماعی (SES) در میان افراد مبتلا به ADHD، با پیوند دادن داده‌های واریانت نادر به داده‌های ثبت‌های دانمارکی، بررسی کردیم. rPTVs تأثیر منفی بر سطح تحصیلات در افراد مبتلا به ADHD داشت؛ rPTVs در ژن‌های محافظت‌شده به طور قابل توجهی با اتمام تنها دوره ابتدایی مدرسه مرتبط بود (OR = ۱.۲۴، s.d. = ۵.۲۳ × ۱۰^-۲، P = ۳.۶۸ × ۱۰^-۵؛ شکل 5a و جدول تکمیلی ۱۴). مطالعات اپیدمیولوژیک نیز به طور مداوم ADHD را با کاهش SES مرتبط دانسته‌اند^۳۴،۳۵. ما دریافتیم که rPTVs در ژن‌های محافظت‌شده به طور قابل توجهی با SES پایین، تعریف‌شده بر اساس دریافت پرداخت تأمین اجتماعی، مزایای بازنشستگی پیش از موعد و/یا بیکاری برای بیش از شش ماه، مرتبط بود (OR = ۱.۲۸، s.d. = ۰.۰۷، P = ۹.۰۹ × ۱۰^-۵). هنگام حذف افراد مبتلا به ID، نتایج برای تحصیلات همچنان معنادار و برای SES به طور اسمی معنادار باقی ماند (شکل 5a).

الف، نسبت شانس (OR) (از رگرسیون لجستیک) برای تحصیلات پایین‌تر و SES پایین‌تر در افراد مبتلا به ADHD که یک یا چند rPTV در ژن‌های محافظت‌شده (pLI ≥ ۰.۹) دارند، در مقایسه با افراد مبتلا به ADHD که rPTV در ژن‌های محافظت‌شده ندارند. این تحلیل همچنین برای افراد مبتلا به ADHD بدون کم‌توانی ذهنی (ADHDwoID) که یک یا چند rPTV در ژن‌های محافظت‌شده دارند، در مقایسه با افراد مبتلا به ADHD بدون کم‌توانی ذهنی (ADHDwoID) که rPTV در ژن‌های محافظت‌شده ندارند، انجام شد. ADHD با تحصیلات پایین‌تر، n = ۶,۴۸۸؛ ADHD با تحصیلات بالاتر، n = ۱,۴۳۶؛ ADHDwoID با تحصیلات پایین‌تر، n = ۵,۲۹۷؛ ADHDwoID با تحصیلات بالاتر، n = ۱,۲۵۳؛ ADHD با SES پایین‌تر، n = ۳,۱۱۰؛ ADHD با SES بالاتر، n = ۳,۲۲۳؛ ADHDwoID با SES پایین‌تر، n = ۲,۵۰۹؛ ADHDwoID با SES بالاتر، n = ۲,۷۷۸). نقاط، تخمین‌های نقطه‌ای OR را نشان می‌دهند و نوارهای خطا، فواصل اطمینان ۹۵٪ (CIs) مربوطه را نشان می‌دهند. ب، ارتباط ضریب هوشی و تعداد واریانت‌های کلاس I فوق‌العاده نادر در نمونه بالینی ADHD آلمان (n = ۹۶۲). نتایج برای تمام ژن‌های اتوزومی و ژن‌های محافظت‌شده (pLI ≥ ۰.۹). تأثیر بر ضریب هوشی، ضریب β از رگرسیون خطی است. نقاط، تخمین‌های نقطه‌ای ضریب β را نشان می‌دهند و نوارهای خطا، فواصل اطمینان ۹۵٪ (CIs) مربوطه را نشان می‌دهند. خط نقطه‌چین در الف نشان‌دهنده OR برابر با ۱ و در ب نشان‌دهنده β برابر با ۰ است.

به طور کلی، افراد مبتلا به ADHD بدون ID که یک یا چند rPTV در ژن‌های محافظت‌شده داشتند، حدود پنج تا هفت برابر بیشتر احتمال داشت که تنها دوره ابتدایی را تمام کرده و SES پایین‌تری داشته باشند، در مقایسه با افراد گروه کنترل در گروه iPSYCH. این احتمال با در نظر گرفتن افراد مبتلا به ID به شش تا هشت برابر افزایش می‌یافت (شکل تکمیلی 10a، b).

ما همچنین تأثیر واریانت‌های کلاس I فوق‌العاده نادر را بر شناخت در نمونه بالینی ADHD ارزیابی کردیم، که در آن کاهش ۲.۲۵ واحدی ضریب هوشی (IQ) به ازای هر واریانت زیان‌آور نادر در ژن‌های محافظت‌شده را شناسایی کردیم (β = -۲.۲۵، P = ۰.۰۲؛ شکل 5b و جدول تکمیلی ۱۵). نتایج ما به درک پژوهشگران از ADHD می‌افزاید و نشان می‌دهد که واریانت‌های زیان‌آور نادر، همسو با واریانت‌های پرخطر رایج ADHD، تأثیر منفی بر عملکرد شناختی و پیامدهای زندگی دارند.

اثر مشترک واریانت‌های رایج و نادر

هنگامی که ما داده‌های GWAS در مورد واریانت‌های رایج در ADHD را تحلیل کردیم، دریافتیم که ۴ ژن از ۲۰ ژن پرخطر برتر با واریانت نادر، به طور اسمی با ADHD مرتبط بودند، از جمله MAP1A (P = ۰.۰۰۵، جدول تکمیلی ۱۶)، اما به طور کلی مجموعه این ۲۰ ژن در همبستگی‌های واریانت‌های رایج غنی‌سازی نشده بود.

اثر مشترک واریانت‌های نادر و رایج در ADHD با ترکیب داده‌های مربوط به واریانت‌های کلاس I با امتیازهای خطر چندژنی ADHD (ADHD-PGSs) که بار خطر واریانت‌های رایج را نشان می‌دهند، ارزیابی شد. با در نظر گرفتن افراد بدون واریانت‌های کلاس I در ژن‌های محافظت‌شده، ADHD-PGS به طور قابل توجهی با افزایش خطر ADHD مرتبط بود (OR_{bin5_vs_bin1} = ۶.۵۲؛ s.e. = ۰.۰۶؛ شکل توسعه‌یافته داده‌ها ۳ و جدول تکمیلی ۱۷)، و این خطر در بین پنجک‌های PGS با الگویی خطی افزایش می‌یافت (شکل توسعه‌یافته داده‌ها ۳). با در نظر گرفتن افراد دارای یک یا چند واریانت کلاس I در ژن‌های محافظت‌شده، خطر ADHD در تمام پنجک‌های PGS به طور قابل توجهی بالاتر بود، در مقایسه با افراد بدون واریانت‌های کلاس I در همان پنجک (به جز پنجک ۴؛ شکل توسعه‌یافته داده‌ها ۳ و جدول تکمیلی ۱۷). این خطر با الگویی خطی تقریباً موازی با آنچه برای افراد بدون واریانت‌های کلاس I مشاهده شد، افزایش می‌یافت، که نشان می‌دهد واریانت‌های رایج و نادر به صورت افزایشی بر خطر ADHD عمل می‌کنند (شکل توسعه‌یافته داده‌ها ۳)، مطابق با مشاهدات در سایر صفات پیچیده^۲۶. همانطور که در شکل توسعه‌یافته داده‌ها ۳ نشان داده شده است، داشتن یک یا چند واریانت کلاس I در ژن‌های محافظت‌شده، خطر ADHD را به سطحی قابل مقایسه با افزایش ۲۰٪ در بار خطر چندژنی واریانت‌های رایج، افزایش می‌دهد.

بار واریانت‌های نادر در میان همبودی‌ها

ما بار واریانت‌های کلاس I و II را در افراد مبتلا به ADHD که همچنین مبتلا به ID (تعداد = ۱,۶۵۴)، اوتیسم (تعداد = ۲,۷۳۰)، اسکیزوفرنی (تعداد = ۴۱۰)، اختلالات مصرف مواد (SUDs؛ تعداد = ۱,۲۰۰)، اختلالات رفتاری اخلالگرانه (DBDs؛ تعداد = ۱,۰۳۶) یا سایر اختلالات روانپزشکی ترکیبی (تعداد = ۵,۴۲۰) تشخیص داده شده بودند، که به آنها چندهمبودی گفته می‌شود، ارزیابی کردیم و آن را با بار در افراد مبتلا به ADHD که این شرایط همبود را نداشتند مقایسه کردیم (حجم نمونه‌ها در جدول تکمیلی ۱۸). واریانت‌های کلاس I و کلاس II در ژن‌های محافظت‌شده در افراد مبتلا به ADHD همراه با ID به طور قابل توجهی افزایش یافته بود، در مقایسه با ADHD بدون ID (شکل توسعه‌یافته داده‌ها 4a و جدول تکمیلی ۱۹). ADHD بدون ID همچنان بار قابل توجهی بالاتری نسبت به گروه کنترل نشان داد، که با یافته‌های قبلی سازگار است^۱۴ (جدول تکمیلی ۱۹ و شکل توسعه‌یافته داده‌ها 4e). بر اساس این نتایج، افراد مبتلا به ID در تحلیل‌های سایر همبودی‌ها حذف شدند. در تحلیل‌های همبودی با اوتیسم، اسکیزوفرنی، SUD، DBDs و چندهمبودی‌ها، هیچ تفاوتی بین افراد دارای همبودی و افراد بدون همبودی در بار واریانت‌های کلاس I و کلاس II در ژن‌های محافظت‌شده (pLI ≥ ۰.۹) وجود نداشت (شکل توسعه‌یافته داده‌ها 4b-d,g,h و جدول تکمیلی ۱۹). علاوه بر این، ما بار واریانت‌های کلاس I و کلاس II را در زیرگروه‌های همبود در هفت مجموعه ژنی (فهرست شده در جدول تکمیلی ۲۰) که نماینده ژن‌های دخیل در اوتیسم، اسکیزوفرنی و اختلالات عصبی-تحولی هستند و در مطالعات قبلی واریانت‌های نادر شناسایی شده‌اند (اطلاعات تکمیلی) ارزیابی کردیم. تمام مجموعه‌های ژنی، به جز یکی، بار افزایش‌یافته‌ای از واریانت‌های کلاس I را در ADHD همراه با ID، در مقایسه با ADHD بدون ID نشان دادند (شکل توسعه‌یافته داده‌ها 5a و جدول تکمیلی ۲۱). در مقایسه با گروه کنترل، ADHD بدون ID بار افزایش‌یافته‌ای از واریانت‌های کلاس I را در چهار مجموعه از ژن‌ها نشان داد و دو مجموعه ژنی برای ADHD بدون چندهمبودی به طور اسمی معنادار باقی ماندند (شکل توسعه‌یافته داده‌ها 5b,c و جدول تکمیلی ۲۱). این نتایج نشان می‌دهد که واریانت‌های زیان‌آور نادر در مجموعه‌های ژنی پرخطر که بر اساس ژن‌های محافظت‌شده یا اختلالات تعریف شده‌اند، حتی در افرادی که شدت بیماری کمتری دارند، یعنی بدون ID یا همبودی‌های روانپزشکی، در ADHD نقش دارند.

هفت مجموعه ژن پرخطر با واریانت نادر، باری افزایش‌یافته با مقداری ویژگی نسبت به همبودی با اختلالاتی که بیشترین ارتباط را با آنها داشتند، نشان دادند، اما نه برای سایر شرایط هم‌زمان. به طور مشخص، هیچ یافته معناداری در تحلیل‌های همبودی با DBDs یا SUD وجود نداشت (شکل توسعه‌یافته داده‌ها 5g,h)، اما هنگام مقایسه ADHD همبود با اسکیزوفرنی با ADHD بدون اسکیزوفرنی، ما بار افزایش‌یافته و اسماً معناداری از واریانت‌های کلاس I را در ژن‌های پرخطر اسکیزوفرنی با واریانت نادر^۱۹ یافتیم (OR = ۷.۲۷، CI = [۱.۶۷, ۳۱.۶۷]، P = ۰.۰۰۸۳؛ شکل توسعه‌یافته داده‌ها 5e و جدول تکمیلی ۲۱). ADHD همبود با اوتیسم نیز بار افزایش‌یافته و اسماً معناداری از واریانت‌های کلاس I را در سه مجموعه ژنی که قبلاً در مطالعات واریانت‌های نادر اوتیسم شناسایی شده بودند، نشان داد، با بالاترین OR مشاهده‌شده برای مجموعه ژنی ‘ASD_FDR0.001’^۲۸ (OR = ۱.۹۴، CI = [۱.۱۵, ۳.۳۰]، P = ۰.۰۱۴؛ شکل توسعه‌یافته داده‌ها 5d و جدول تکمیلی ۲۱).

هیچ تأثیر قوی از واریانت‌های کلاس II بر خطر همبودی شناسایی نشد—حداقل نه در مجموعه‌های ژنی مورد بررسی (شکل‌های توسعه‌یافته داده‌ها 4b-d,g,h و 5d-h و جداول تکمیلی ۱۹ و ۲۱).

به طور کلی، نتایج ما نشان می‌دهد که سهم واریانت‌های کلاس I در خطر همبودی‌های روانپزشکی (به جز ID) در ADHD، تا حدی ناشی از واریانت‌ها در مجموعه‌هایی از ژن‌های پرخطر خاص مرتبط با همبودی مورد نظر است، به جای اینکه نتیجه یک بار افزایش‌یافته عمومی در میان ژن‌های بسیار محافظت‌شده باشد.

واریانت‌های نادر در ADHD و اوتیسم

در مطالعه قبلی ما در مورد واریانت‌های نادر در ADHD و اوتیسم^۱۴، هیچ تفاوتی در توزیع ژن‌های تحت تأثیر rPTVs در این دو اختلال نیافتیم. ما اکنون حجم نمونه را برای هر دو اختلال ADHD و اوتیسم به طور قابل توجهی افزایش داده‌ایم و مجدداً بررسی کرده‌ایم که آیا توزیع ژن‌های محافظت‌شده با واریانت‌های نادر کلاس I، کلاس II و مترادف در ADHD تنها (تعداد = ۵,۵۳۶) و اوتیسم تنها (تعداد = ۷,۵۵۴) همچنان همان توزیع زیربنایی را دارد یا خیر، با استفاده از آزمون C-alpha^۳۶ همانطور که قبلاً استفاده شد^۱۴. ما هیچ تفاوت معناداری بین ژن‌های پرخطر ADHD و اوتیسم برای هیچ یک از گروه‌های واریانت تحلیل‌شده نیافتیم (جدول تکمیلی ۲۲)، چه با در نظر گرفتن افراد مبتلا به ID و چه بدون آن. در مقابل، هنگام مقایسه ADHD تنها با گروه کنترل، تفاوت‌های معناداری در توزیع ژن‌های تحت تأثیر هر دو واریانت کلاس I (P = ۸.۰۹ × ۱۰^-۹) و کلاس II (P = ۰.۰۰۳) مشاهده شد، و همین امر هنگام مقایسه اوتیسم تنها با گروه کنترل برای واریانت‌های کلاس I نیز صادق بود (P = ۰.۰۱۴؛ جدول تکمیلی ۲۲). این نتایج نشان می‌دهد که اشتراک قابل توجهی از ژن‌های پرخطر با واریانت نادر بین ADHD و اوتیسم وجود دارد و واریانت‌های زیان‌آور ممکن است بر فرآیندهای مشترک عصبی-تحولی تأثیر بگذارند.

بحث

در این مطالعه، ما درک پژوهشگران از نقش واریانت‌های کدکننده نادر در خطر ADHD و همبودی‌های آن را ارتقا دادیم، ارتباط آنها با پیامدهای مهم زندگی را آشکار کردیم و اجزای پاتوفیزیولوژیک را در خطر ناشی از واریانت‌های نادر ADHD دخیل دانستیم.

ما سه ژن پرخطر معنادار با واریانت نادر را برای ADHD شناسایی کردیم (MAP1A، ANO8 و ANK2). MAP1A پروتئینی را کد می‌کند که در مونتاژ میکروتوبول‌ها نقش دارد^۳۷، و بنابراین می‌توان فرضیه داد که اختلال در این ژن از طریق اختلال در عملکرد اسکلت سلولی، خطر ADHD را ایجاد می‌کند، که بر تشکیل و عملکرد سیناپس در نورون‌ها تأثیر می‌گذارد^۳۸،۳۹. قابل ذکر است که rPTVs در ژن خواهر MAP1A یعنی MAP1B گزارش شده است که باعث ID، اوتیسم و نقص‌های گسترده در ماده سفید مغز می‌شود^۴۰. هر دو ژن ANK2 و ANO8 پروتئین‌هایی را کد می‌کنند که در انتقال یون کلسیم از طریق غشای پلاسما نقش دارند^۴۱،۴۲، که نشان می‌دهد کانالوپاتی‌های سیناپسی نورونی در ADHD دخیل هستند. این ایده همچنین توسط نتایج غنی‌سازی مجموعه ژنی ما پشتیبانی شد و با آنچه برای اوتیسم پیشنهاد شده است، همخوانی دارد^۴۳.

حدود ۵۰٪ و حدود ۳۰٪ از سیگنال همبستگی به ترتیب برای MAP1A و ANO8، ناشی از واریانت‌های زیان‌آور نادر در افراد مبتلا به ADHD تنها (بدون همبودی اسکیزوفرنی، ID یا اوتیسم) بود، در حالی که سیگنال ANK2 عمدتاً ناشی از ADHD همراه با اوتیسم یا ID هم‌زمان بود. این با این واقعیت سازگار است که ANK2 یک ژن پرخطر شناخته‌شده با واریانت نادر در اوتیسم است^۲۸. MAP1A و ANO8 در مطالعات دیگر با ASD یا سایر شرایط عصبی-تحولی مرتبط نبوده‌اند^۱۹،۲۸، اگرچه MAP1A هنگام ترکیب واریانت‌های زیان‌آور نادر در هر دو اختلال ADHD و ASD معنادار بود، اما در مطالعه قبلی ما هنگام بررسی جداگانه اختلالات، معنادار نبود^۱۴. بحثی در مورد تأثیر بالقوه اوتیسم همبود بر نتایج را می‌توان در اطلاعات تکمیلی یافت.

هنگام ارزیابی ۲۰ ژن پرخطر برتر ADHD که در اینجا شناسایی شدند، ۹ ژن با اوتیسم و/یا سایر اختلالات عصبی-تحولی مرتبط بوده‌اند (FDR < ۵٪)^۲۸، که اعتبار یافته‌های ما را تأیید می‌کند. شانزده مورد از این ژن‌ها از نظر تکاملی محافظت‌شده هستند (جدول تکمیلی ۴)، که نشان می‌دهد بسیاری از ژن‌هایی که ما در مطالعات واریانت نادر شناسایی می‌کنیم، ژن‌هایی هستند که در فرآیندهای اساسی عصبی-تحولی نقش دارند و احتمالاً بین اختلالات مشترک هستند. با این حال، قابل ذکر است که در میان ژن‌های برتر ما، ژن‌هایی نیز وجود دارند که قبلاً توسط واریانت‌های نادر با اختلالات روانپزشکی مرتبط نشده‌اند و ممکن است بیشتر مختص ADHD باشند.

یک مطالعه قبلی^۴۴، KDM5B را به عنوان یک ژن پرخطر بالقوه با واریانت نادر برای ADHD شناسایی کرد (FDR = ۰.۰۴). اگرچه KDM5B در این مجموعه داده بزرگتر به طور معناداری با ADHD مرتبط نبود و در میان ۲۰ ژن برتر ما قرار نداشت، اما سیگنال همبستگی متوسطی با OR ۲.۹۳ (P = ۱.۲۳ × ۱۰^-۳) نشان داد.

واریانت‌های زیان‌آور نادر در ژن‌های محافظت‌شده بیشترین تأثیر را بر خطر ADHD داشتند، همانطور که قبلاً برای ADHD^۱۴، اوتیسم^۲۸،۴۵ و اسکیزوفرنی^۱۹ گزارش شده است. نکته قابل توجه این است که ما بار افزایش‌یافته‌ای از واریانت‌های زیان‌آور نادر را در ژن‌های محافظت‌شده در افراد دارای شرایط همبود، در مقایسه با کسانی که فقط ADHD داشتند (با حذف ID)، مشاهده نکردیم؛ به همین ترتیب، ما نتوانستیم تفاوت‌هایی در توزیع ژن‌های تحت تأثیر واریانت‌های زیان‌آور نادر در ADHD و اوتیسم شناسایی کنیم. با این حال، ما بار افزایش‌یافته‌ای را در ADHD همراه با شرایط همبود در مجموعه‌های ژنی خاصی که نماینده ژن‌های پرخطر عصبی-تحولی هستند، شناسایی کردیم. این نشان می‌دهد که شرایط همبود—به غیر از ID—با افزایش کلی بار خطر واریانت نادر در ژن‌های محافظت‌شده مرتبط نیستند، بلکه با افزایش بار در مجموعه کوچکتری از ژن‌های پرخطر خاص مرتبط هستند. بنابراین، با افزایش حجم نمونه، ممکن است بتوانیم ژن‌های پرخطر با واریانت نادری را که بیشتر مختص یک اختلال هستند، شناسایی کنیم.

با بررسی پیامدهای بیولوژیکی ژن‌های پرخطر با واریانت نادر شناسایی‌شده، شبکه‌های PPI گسترده‌تر سه ژن معنادار، غنی از ژن‌های پرخطر با واریانت نادر برای اوتیسم، DD و اسکیزوفرنی بودند که اعتبار یافته‌های ما را تأیید می‌کند و این نتیجه‌گیری را تقویت می‌کند که ژن‌های پرخطر با واریانت نادر و پروتئین‌های در تعامل با آنها به احتمال زیاد بر شبکه‌های ژنی درگیر در فرآیندهای اساسی عصبی-تحولی تأثیر می‌گذارند. غنی‌سازی به چندین سازوکار بیولوژیکی یا اجزای سلولی اشاره داشت که به طور بالقوه می‌توانند در افراد مبتلا به ADHD تحت تأثیر قرار گیرند، از جمله عملکردهای پیش‌سیناپسی و پس‌سیناپسی که برای هر سه شبکه شناسایی شدند. تحلیل‌های ما همچنین نورون‌های دوپامینرژیک را در ADHD دخیل دانستند. این فرضیه مطرح شده است که اختلال در تنظیم دوپامین در مغز در ADHD نقش دارد، به دلیل مشاهده اینکه داروهای محرک مانند متیل‌فنیدات، اغلب علائم ADHD را با موفقیت درمان می‌کنند^۴۶. متیل‌فنیدات ناقل دوپامین را مسدود می‌کند، که غلظت انتقال‌دهنده‌های عصبی را در شکاف سیناپسی افزایش می‌دهد^۴۷.

علاوه بر این، ما دریافتیم که ۲۰ ژن پرخطر برتر، میانگین بیان بالایی در تمام مراحل رشد مغز دارند، که نشان می‌دهد این ژن‌ها نقش‌های کلیدی هم در رشد و هم در عملکرد مغز در طول عمر دارند. در راستای این موضوع، ما هم نورون‌های نابالغ (نوروبلاست‌های میانی) و هم نورون‌های گابائرژیک و دوپامینرژیک بالغ را به عنوان غنی‌شده برای بیان ژن‌های پرخطر با واریانت نادر شناسایی کردیم (همانطور که در بالا ذکر شد). این نشان می‌دهد که مجموعه متنوعی از اختلالات عملکردی نورونی می‌تواند در ADHD دخیل باشد. هنگام ترکیب اثرات واریانت‌های نادر و رایج، مشخص شد که واریانت‌های نادر به صورت افزایشی با PGS واریانت‌های رایج عمل می‌کنند. انواع سلول‌های عصبی، از جمله نورون‌های دوپامینرژیک، در تحلیل‌های واریانت‌های پرخطر رایج ADHD نیز برجسته شده‌اند^۱۳، و سازوکارهای بیولوژیکی تحت تأثیر ممکن است (تا حدی) بین واریانت‌های رایج و نادر مشترک باشند. همگرایی در سازوکارهای بیولوژیکی تحت تأثیر توسط واریانت‌ها در سراسر طیف آللی ممکن است یک ویژگی مشترک اختلالات روانپزشکی عصبی-تحولی باشد، با توجه به اینکه این امر برای اسکیزوفرنی نیز مشاهده شده است^۱۹.

با ارزیابی پیامدهای اقتصادی-اجتماعی مرتبط، ما دریافتیم که افراد مبتلا به ADHD که حامل یک یا چند واریانت زیان‌آور نادر هستند، پیشرفت تحصیلی و وضعیت اقتصادی-اجتماعی به طور قابل توجهی ضعیف‌تری نسبت به افراد مبتلا به ADHD که این واریانت‌ها را ندارند، دارند (حتی با حذف ID همبود). در مقایسه با جمعیت عمومی دانمارک، افراد مبتلا به ADHD که حامل یک یا چند واریانت زیان‌آور هستند، بیش از پنج تا هفت برابر بیشتر احتمال دارد که این پیامدهای تحصیلی یا اقتصادی-اجتماعی پایین‌تر را تجربه کنند. به همین ترتیب، واریانت‌های زیان‌آور فوق‌العاده نادر تأثیر منفی قابل توجهی بر ضریب هوشی در بزرگسالان مبتلا به ADHD داشتند. بنابراین، واریانت‌های زیان‌آور نادر نه تنها بر تشخیص ADHD بلکه بر پیامدهای مهم زندگی نیز تأثیر می‌گذارند، که با این مشاهده که بار افزایش‌یافته واریانت‌های پرخطر رایج ADHD با کاهش عملکرد در طیف وسیعی از معیارهای شناختی مرتبط است^۱۳، سازگار است. این یافته‌ها نشان می‌دهند که ADHD یک اختلال چندژنی با یک جزء ژنتیکی است که بر حوزه‌های شناختی خاصی تأثیر می‌گذارد و این می‌تواند برای برخی افراد، به ویژه در محیط‌های تحصیلی، چالش‌هایی ایجاد کند. این بینش می‌تواند به توسعه اقدامات حمایتی و رویکردهای نوآورانه برای ایجاد محیط‌های یادگیری بهتر برای افراد مبتلا به ADHD کمک کند.

به طور خلاصه، ما نشان می‌دهیم که ژن‌های حامل واریانت‌های پرخطر زیان‌آور نادر تأثیر قابل توجهی بر ADHD، شرایط همبود آن و پیامدهای کلیدی دارند. ما پیامدهای بیولوژیکی خطر ناشی از واریانت‌های نادر را آشکار می‌کنیم و نشان می‌دهیم که خطر ناشی از واریانت‌های نادر و رایج در ADHD به صورت افزایشی عمل می‌کنند. در حالی که ژن‌های پرخطر توصیف‌شده در اینجا تنها بخشی از کل خطر ناشی از واریانت‌های نادر را توضیح می‌دهند، مطالعه ما راهی را برای شناسایی بسیاری از ژن‌های پرخطر دیگر که هنوز کشف نشده‌اند، برای پیشبرد درک ما از پاتوفیزیولوژی ADHD، فراهم می‌کند.